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法医物证作业指导书

作者:admin 来源:本站 发表时间:2017/1/12 17:12:12 查看:
法医物证作业指导书

湘中司法鉴定中心

作业指导书

文件编号

FSC07—TD—M-2

页号

第1页共9页

版次

第一版第1次修改

标题

STR 与性别位点基因型检测

审核人

倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2014年12月12日

1.目的

   通过对D3S1358等STR位点的基因型检测,进行亲子鉴定和个体识别。

2.适用范围

   本作业指导书适用于法医物证学实验室对刑事、民事以及非诉讼案件中人体血液(斑)、

羊水、带毛囊毛发、混合斑、精斑、组织等生物学检材的DNA基因型检验以及性别位点的检测。

3.职责

   中心主任批准具有法医物证鉴定资格的鉴定人履行此项工作。

4.试剂

   本法所用试剂为分析纯,在有效期内使用;使用pH试纸测定溶液的pH值。

   4.1 10mg/ml蛋白酶K:lmg蛋白酶K溶于100μl双蒸水中,每管30μl分装,冰箱冻存。

   4.2 lmol/L DTT:称取0. 77g DTT,加入5ml双蒸水,溶解后加入50μl lmol/l NaAc(pH 5.2),混匀。

   4.3  Chelex 100 (50-100 mesh):5g Chelex 100加双蒸水至50ml,检查pH为9-11。    

   4.4  0. 5mol/L EDTA:于800ml双蒸水中加入186. 1g Na2EDTA - 2H2O,在磁力搅拌器上搅拌溶解(可加20g NaOH助溶,此时pH=8.0士0.2)。检查pH,用水定容至1L。

4.5  Powerplex 16 System扩增试剂盒(Promega公司):冰箱冻存。

4.6  GeneScan-600 [ILS] ( Promega公司):2-6℃保存。

   4.7  POP-4(ABI公司):2-6℃保存。

  5.设备仪器

   5.1  310 型遗传分析仪。

   5.2  9700型PCR扩增仪。

   5.3  振荡器。

   5.4  台式高速离心机。    

   5.5  恒温干燥箱。

   5.6  计算机。

6.原理

   从生物学检材中抽提DNA,针对D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E,D5S818, Dl3S317, D7S820, Dl6S539, CSFIPO, Penta D,vWA, D8Sl l79, TPOX, FGA等STR位点和性别位点Amelogenin进行复合PCR扩增,将扩增产物进行电泳分析,确立基因型。

7.程序

   7.1  DNA提取

   7.1.1从血样中提取DNA:

   (1) 在1.5ml离心管中加1ml双蒸水,然后加入3μl全血(约9mm2血斑),小心混匀;

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STR 与性别位点基因型检测

审核人

倪  俊

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曾介良

发布日期

2014年12月12日

   

室温保温30min,间歇振荡;

   (2) 10000-15000 r/min离心2-3min;小心移去上清液。若样品为血斑,则保留载体;

   (3) 沉淀中加入10% Chelex 100 (50-100mesh) 200μl; 56℃保温30min;

   (4) 高速振荡5-10sec; 100℃ 8min;

   (5) 高速振荡5-10sec; 10000-15000 r/min离心2-3min,取上清液用于PCR扩增;2-8℃保存或冻存剩余DNA。

   7.1.2从毛发中提取DNA:

   (1) 用三蒸水清洗毛发;剪取毛根部分;放入1.5ml Eppendorf管中;

   (2) 加入200μl 10% Chelex 100(50-100 mesh)及2μl 10mg/ml  PK(蛋白酶K) , 56℃ 保温6-8hr或过夜;

   (3) 高速振荡5-10sec;沸水煮8min(注意毛发应浸没于Chelex液);

   (4) 高速振荡5-10sec;10000-15000 r/min离心2-3min;取上清液用于扩增反应,2-8℃保存或冻存剩余DNA。

   7.1.3从口腔刮拭物样本中提取DNA:

   (1) 用牙签刮拭口腔粘膜,将其放入1. 5ml离心管内,加入200μl 10% Chelex (50-100 mesh);搅动,使细胞脱落;  

(2) 56℃保温15-30min;

   (3) 高速振荡5-10sec;100℃ 8min;

   (4) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心2-3min;

   (5) 取上清液用于扩增反应;2-8℃保存或冻存剩余DNA。

   7.1.4从唾液斑中提取DNA:

   (1) 取9mm2唾液斑放入1.5ml离心管中,加1ml三蒸水于室温浸泡30min;

   (2) 用牙签搅动使载体细胞脱离载体,去除载体;10000-15000 r/min离心lmin;

   (3) 去上清仅留50μl,用无菌吸头吹打沉淀;加10 % Chelex 100 (50-100 mesh)至200μl, 56℃保温15-30min;

   (4) 高速振荡5-10sec;100℃ 8min;

   (5) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心2-3min;取上清液用于扩增反应;2-8℃保存或冻存剩余DNA.

   7.1.5从精液中提取DNA:

   (1) 取3μl精液放入1. 5ml离心管内,加入200μl 10% Chelex 100(50-100 mesh) ;

   (2) 加入2μl 10mg/ml蛋白酶K和7μl lmol/L DTT,轻轻混匀;

   (3) 56℃保温30-60min,高速振荡5-10sec;

   (4) 10000-15000 r/min离心10-20sec;

   (5) 100℃ 8min;

   (6) 高速振荡5-10sec;

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(7) 10000-15000 r/min离心3min;

   (8) 取上清液用于扩增反应;

   (9) 2-8℃保存或冻存剩余DNA,再次使用时重复步骤6-8.

   7.1.6从精斑样品中提取DNA:

   (1) 取适量精斑检材,剪碎后放到1. 5ml离心管中;

   (2) 加入1ml三蒸水,室温保温30min;

   (3) 高速振荡lmin,用牙签去除载体;

   (4) 10000-15000 r/min离心2min;

   (5) 去上清仅留50μl,用无菌吸头吹打沉淀;

   (6) 取3μl悬液经染色后镜检;

   注:如果检出上皮细胞,则按混合斑DNA提取法操作;

   (7) 加入10 % Chelex100 (50-100 mesh)至200μl,加入2μl 10mg/ml蛋白酶K和7μl lmol/L DTT,轻轻混匀;

   (8) 56℃保温60min;

   (9) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心10-20sec;

(10) 100℃ 8min;  

(11) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心3min;

   (12) 取上清液用于扩增反应;

   (13)  2-8℃保存或冻存剩余DNA,再次使用时重复步骤11-12。

   7.1.7从混合斑样本中提取DNA:

   (1) 取适量检材,剪碎后放入1.5ml离心管中,加1ml三蒸水;

   (2) 室温浸泡30min;

   (3) 用牙签搅动2 min,使载体细胞脱离载体,去除载体(注意:待基液中镜检到精子后再弃去载体);

   (4)  10000-15000 r/min离心lmin;

   (5) 去上清仅留50μl,用无菌吸头吹打沉淀;

   (6) 取3μl悬液放于载玻片上,经染色后镜检;

   (7) 如果无上皮细胞检出,则直接从步骤13开始操作;

   (8) 加灭菌水150μl,再加2μl10mg/ml蛋白酶K,轻轻混匀;

   (9) 保温1-2hr以消化阴道上皮细胞(注:不得超过2hr,否则精子细胞也会被消化);

   (10) 10000-15000 r/min离心5min;

   (11) 取150μl上清液与50μl 40 % Chelex 100(50-100 mesh)混合,以备女性DNA分析检验,见步骤14;

   (12) 悬浮沉淀于0.5ml精子洗涤液(10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA,

50mmol/L NaCl, 2 % SDS, pH 7.5),振荡片刻,10000-15000 r/min离心5min,去上清仅留

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50μl,重复2次;

   (13) 悬浮沉淀于1ml三蒸水,振荡片刻,10000-15000 r/min离心5min,去上清仅留50μl,用无菌吸头吹打沉淀,取3μl镜检;

   (14) 加150μl 10% Chelex 100(50-100 mesh), 2μl10mg/ml蛋白酶K及7μl lmol/L DTT,轻轻混匀;

   (15) 56℃保温60min;

   (16) 剧烈振荡女性阴道上皮细胞及精子细胞样品5-10sec,100℃ 8min;

   (17) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心3min,取上清液用于扩增反应;

   (18) 2-8℃保存或冻存剩余DNA,再次使用时重复步骤16。    

   7.1.8从含精子的口腔拭子中提取DNA:

   (1) 用棉签刮拭口腔粘膜,取适量拭物放入1.5ml离心管中,加入1ml无菌双蒸水;

   (2)室温保温30min;

   (3) 用牙签搅动2min使细胞脱落,去除牙签和纤维;

   (4) 10000-15000 r/min离心2min;

   (5) 去上清仅留50μl,吹打,取3μl镜检。如果检出精子头,则按混合斑DNA提取法从步骤7开始操作。  

   本实验室常规采用Chelex法抽提DNA,对于质和量不确定的检验材料(如精斑、混合

斑、石蜡包埋块等),在抽提DNA后,通过对DNA溶液进行系列稀释(如2倍、10倍、100倍),然后采用DNA扩增试剂进行扩增分析(操作按说明书进行),通过电泳条带荧光强度的观察确定适宜的DNA模板浓度,再正式按以下步骤进行检测。

   7.2检测

   7.2.1  PCR扩增

   常规使用商品化的Powerplex 16 System试剂盒,进行15个STR位点及1个性别位点的基因型检验。若使用其他扩增检测体系,则必须先进行可行性测试,确认其合格。需要增加其他STR位点的检测时,可使用商品化试剂盒或其他合格产品,操作按使用说明书进行。

   “Powerplex 16 System”试剂盒用于检测性别位点Amelogenin和下述15个STR位点: D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E,D5S818, Dl3S317, D7S820, Dl6S539, CSFIPO, Penta D,vWA, D8Sl l79, TPOX, FGA。

   PCR反应体系准备如下(每样本PCR反应总体积为25μl):

   (1) 将0.2ml PCR薄壁管(数量与待扩增样本数相同)置于管架上,于管壁做好标记;

   (2) 取1个0.5ml Eppendorf管,将下述试剂在其内混合均匀:

   样本数×18.2μl 去核酸酶纯净水

   样本数×2.5μl 10×Primer Pair Mix;

样本数×2.5μl 10×Buffer

样本数×0.8μl AmpliTaq Gold Polymerase (5U/μl);

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(3) 分装至各个0. 2ml PCR薄壁管中,每管24μl;

   (4) 每管加入相应的DNA样本1μl;

   (5) 低速离心l0s,用扩增仪按下列条件进行PCR反应:

   95 for 11 minutes, then:

96 for 1 minute, then:

ramp 100% to 94 for 30 seconds

ramp 29% to 60 for 30 seconds

ramp 23% to 70 for 45 seconds

for 10 cycles, then:

ramp 100% to 90 for 30 seconds

ramp 29% to 60 for 30 seconds

ramp 23% to 70 for 45 seconds

for 22 cycles, then:

60 for 30 minutes

4 soak

   7.2.2样本检测前检查项目及使用操作条件(使用310型遗传分析仪,按说明书

进行。以下详述310型遗传分析仪及其软件的使用步骤):

   (1) 仪器标签:是否为准用标签;

   (2) 使用记录:上一次使用是否正常;

   (3) 毛细管位置:是否处于正常位置;

   (4) 稳压电源:是否正常;

   (5) CCD:垂直30,水平141;

   (6) Gel Pump Force: 265;

   (7) Syringe(max. travel): 583;

   (8) 胶液:POP4;

   (9) 毛细管:长度47cm,管径50um;

   (10) 环境温度:20℃-30℃。

   检查完毕,按下列次序开机:稳压电源一310型遗传分析仪主机。

   7.2.3扩增产物的毛细管电泳及信号收集

   打开稳压电源开关,开启310 DNA遗传分析仪和计算机;

(1毛细管回位(手工操作:将保存于缓冲液中的毛细管恢复到原来的位置,使毛细管末端比电极末端长0. 5mm) ;

(2) 双击计算机桌面上的Collection图标,在Window菜单中选择“Manual Control”命令,从“Function”弹出菜单中选择“Syringe Home”,再点“Execute”,使注射器回位;

(3) 从“Manual Control”命令的“Function”中选择“Autosampler HomeX, Y Axis”,再

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点“Execute”,使自动进样架的X轴和Y轴回位;

(4) 从“Function”中选择“Autosampler Home Z Axis”,再点“Execute”,使自动进样架的Z轴回位;

   (5) 在“Instrument”菜单中选择“Autosampler Calibration”, 点“Start”,(等待数秒钟)取出样品架,将毛细管对准自动进样架前部的黑点(通过“Page Up"键移动自动进样架,待快接近时按“Shift”+“Page Up”键,使黑点位于毛细管与电极之间,但更靠近毛细管。若需调整左右位置,则用“Shift”+“←”或“→”键进行操作);

(6) 按“Set”,用同样方法使毛细管对准自动进样架后部的黑点;

(7) 按“Done”,至此完成自动进样架的校正;

   (8) 将注射器取下,吸取0.2-0.4ml POP-4溶液(注:从冰箱冷藏室取出POP-4后,需放置至室温再使用);

(9) 装上注射器,从“Manual Control”命令的“Function”,中选择“Syringe down”,输入“200”,按“Execute”,再逐步输入“100”、“50”、“20”、“10”、“5”等值,注意观察每次命令执行后升降架与注射器的位置,最终使注射器处于恰能注胶至毛细管的位置;

   (10) 从“Manual Control”命令的“Function”中选择“Temperature Set”,输入“60”,按“Execute”,使热板被加热至60℃

   (11) 按下述步骤准备样本:

   准备0.2 ml分析管,于管壁作好标记(写上待分析样本的名称);每管加入24μl去离子甲酰胺及1μl GeneScan-600[ILS];加入相应的PCR产物1ul(注:每批样本中宜设置1管基因梯度标准Allelic Ladder,此管含24μl去离子甲酰胺、1μl GeneScan-600[ILS]及1μl Allelic Ladder),95℃变性3min,随即冰浴3min后,将各管内液体移入标记好的0. 5 ml分析管,将管盖剪去,按次序置于48孔样本架上;

   (12) 打开“310”门,按一下门内的“Tray”键,放入48孔样本架,再按一下“Tray”键,关上门;

(13) 按下述步骤制订样本表(注:样本表可按工作计划提前制订):

(14) 启动310 Collection软件,在“File”菜单中选“New”,单击“GeneScan

Smpl Sheet”图标;

   (15) 在“Sample”栏按次序填上各样本的名称,随后将“Sample”栏的信息复制到“Info”栏;

   (16) 在“File”菜单中选“New”,单击“GeneScan Injection List”图标;

(17) 在“Sample Sheet”中选出所需的样本表,按“RUN”

    (18) 在“WINDOW”,菜单中选择“Status”命令;

(19) 分别单击“GeneScan Injection List”窗口和“Status”窗口右上角的“最小化”标志,使其只显示标题栏,便于在收集信息的同时进行GeneScan和Genotyper分析。

     

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7.2.4扫描分析(GeneScan)

   按下述步骤进行操作:

   (1) 双击GeneScan图标(启动该软件);

   从“ Settings'’菜单选择“Analysis Parameters”,按下述条件进行设置(详见“Profiler Plus”说明书p. 8-9),然后按“OK”:

      Analysis Range                Size Call Range

   .This Range(Data Points)        This Range(Base Pairs)

     Start:3600                    Min60

     Stop:10000                  Max: 1200

     Data Processing               Size Calling Method

   .Baseline                    Local Southern method

   .Multicomponent

     Smooth Option

   .Light

     Peak Detection               split Peak Correction

       B50   Y:50

       G50   R:50

   Min Peak Half Width:2    Correction Limit:30  Data Pts

   (2) 在“File”,菜单中选择“New”,单击“Project”;

   (3) 从“Project”菜单中选择“Add Sample Files”,在对话框中选取待分析的样本文件夹(路径为:HD\ABI 310\RUNS\run folder);

   (4) 选中所有样本,在“Sample”菜单中选择“Install New Matrix”,选取所建立的Matrix本件,按“OPEN”;

   (5) 在“Standard”栏中选“Define New”,按下列值定义内标各峰的大小:60、80、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600;

   (6) 选中所有样本,按“Analyze”键;

   (7) 在“VIEW”菜单中选择“Align By Size”,在“WINDOW”菜单中选择“ResultsControl”,检查所有样本中GeneScan-60 [ILS]的大小是否定义正确;若某样本有错,则需重新定义其内标的各峰大小值,并重新分析;    

   (8) 从“File”,菜单选“Save as”,保存GeneScan结果。

   7.2.5基因型检测(Genotyper)

对Powerplex 16 System试剂盒的扩增产物均按下述步骤操作:

   (1) 双击“PowerTyper 16 Macro”图标(启动);

   (2) 从“File”,菜单选“Import GeneScan Files”,选取待用于基因型分析的GeneScan

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结果文件(Project),在“R”旁打上“ⅹ”,按“Import”;  

(3) 在主窗口的宏命令中选择“check GS 600”,再从“Macro”菜单中选择“Run Macro”,检查每个样本的内标是否定义正确;

   (4) 在主窗口左下角的宏命令中选择“Kazam (20 % Fiter)”,再从“Macro”菜单中选择

“Run Macro”;

   (5) 检查“Ladder”的分析结果是否正确;

   (6) 查看各样本的分析结果(若想放大显示某区域,可用鼠标单击并选中该区域,再按键盘上的组合键“Command”“R”)。若发现杂峰(小的非特异性峰)亦被标记上了基因名,可将鼠标指针移至此处,单击,这样可删去标记;

   (7) 如果需要查看某峰的大小,可将鼠标指针移至此处,双击。从“Analysis”菜单中选“Change Labels”,在“the category's name”前打上“ⅹ”,则可恢复显示基因名;

   (8) 在主窗口左上部G处单击,从“Views”菜单中选“Show Plot Window”,从“File”菜单选“Print”,可打印带绿色荧光标记的扩增产物的检测结果;

   (9) 在主窗口左上部“Y”处单击,从“Views”菜单中选“Show Plot Window”,从“File”菜单选“Print”,可打印带黄色荧光标记的扩增产物的检测结果;

   (10) 在主窗口左上部“B”处单击,从“Views”菜单中选“Show Plot Window”,从“File”

菜单选“Print”,可打印带蓝色荧光标记的扩增产物的检测结果;

   (11) 在主窗口左下角的宏命令中选择“310 Make Table”,从“Macro”菜单中选择“Run Macro”,从“View”菜单中选择“Show Table Window”,即可以全屏方式显示表格;如果表格中某处需要修改,先选中此处,再从“Edit”菜单中选“Edit Cell”,输入正确值,按“OK”;

   (12) 从“File”菜单选“Print”,可打印上述表格;从“Table”菜单选“Export to File”,可将此表格存为Excel可读文本;

   (13) 从“File”菜单选“Save as”,输入文件名,可保存Genotyper结果。

   7.2.6样本检测后检查项目:

   (1) 样本架X,Y,Z轴复位;

   (2) 毛细管末端浸入缓冲液中;

   (3) 关主机;

   (4) 关闭电源;

(5) 清理现场。

8.异常情况处理

8.1意外停电

关闭所有电源,等来电后,重新开启电源,重复分析被中断的样品。

8.2电流过高

调换新鲜POP胶。

8.3没有电流

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  重新配制电极缓冲液;取下“Pump Block”洗净;旋紧固定器和注射器;保证毛细管紧贴热板;重新校正“Autosampler”

8.4电泳出峰时间进行性延迟

彻底清洗注射器或调换注射器,重新电泳。

8.5电泳出峰时间进行性缩短

用少量POP胶灌注注射器,弃去,再吸取适量POP胶,重新电泳。

8.6基线高

用95%甲醇清洗毛细管窗口,保证毛细管窗口位置对准激光窗口。

8.7无电泳信号

校准毛细管和电极;将上样样品管重新离心;调换样品管橡皮塞。

8.8不能自动分析数据

   正确完成样品表(Sample Sheet);正确完成进样表(Injection List);正确设置收集软件(Collection Software)中的参数。

8.9不能吸到样品

   重新校正“Autosampler”;取出样品管离心。

9.质量控制

9.1 DNA抽提、PCR体系准备、PCR扩增及产物检测在不同房间或不同区域进行。

实验室不同区域器材严禁交叉使用。

9.2 在样本处理过程中,每吸取一次样本注意更换一个枪头。

9.3使用新批号的扩增试剂盒之前以及在每个案例的检测分析中,均以标准样本(已知浓度和基因型的Control DNA)为阳性对照,同时设置阴性空白对照,扩增检测后观察系统的有效性。

9.4每次进行STR实验检测时,均设立等位基因梯度(Ladder),其分辨率、信号强度或准确度均应符合“310遗传分析仪自检规程”列表中的技术指标。

9.5定期进行标准样品(已知浓度和基因型的Control DNA)和以前检测过的、已知基因型样本的检验,验证本实验室检测结果的稳定性和可靠性。

10.相关记录

10.1  ABO血型及STR基因型测试原始记录   FSC07—TD—M04

11.支持性文件

11.1中华人民共和国公共安全全行业标准,法庭科学DNA实验室检验规范 GA/T 383-2002。

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版次

第一版第1次修改

标题

种属与ABO血型物质检测

审核人

倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2014年12月12日

1.目的

   用免疫血清学和生物化学的理论和方法,检验生物学检材是否含有人血、人精斑。对于新鲜血样,检测其ABO血型。

2.适用范围

   适用于法医物证学实验室对刑事、民事以及非诉讼案件中血液(斑)、精液(斑)检材的检验。

3.职责

   中心主任批准具有法医物证鉴定资格的鉴定人履行此项工作。

4.试剂

   本法所用试剂为化学纯,在有效期内使用。

   4.1联苯胺无水乙醇饱和液:取1g联苯胺于棕色瓶内,加无水酒精适量,至大部分联苯胺溶解,剩余少许联苯胺未溶(呈过饱和状态),置室温保存。

   4.2 3%过氧化氢溶液:取过氧化氢原液100μl(30% ),加双蒸水900μl,混匀,置于冰箱冷藏。

   4.3 冰醋酸。

   4.4 抗人Hb金标检验试剂条(公安部第二研究所);

   4.5 抗A、抗B血清(上海市中心血站)。

   4.6 精斑预试验缓冲液:拘椽酸1.4g, lmol/L氢氧化钠12.5ml,磷酸苯二钠0.2g, 4-氨基安替比林0.6g,加蒸馏水至100ml,置冰箱冷藏。

   4.7 精斑预试验显色液:lmol/L氢氧化钠16.7ml,碳酸氢钠1.4g,铁氰化钾3.6g,加蒸馏水至100ml,置冰箱冷藏。

   4.8 Baecchi染色液:1%亚甲蓝lml, l%酸性品红lml,1%盐酸40ml。置室温保存。

   4.9 PSA免疫层析试剂条(公安部第二研究所)。

5.设备仪器

   5.1恒温箱。

   5.2天平。

   5.3离心机。

   5.4显微镜。

   5.5白瓷板。

6.程序

   6.1新鲜血液的检验:

   6.1.1肉眼检查

   新鲜血液呈鲜红色,干燥后逐渐变为暗红色、褐色、暗褐色。

 

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第一版第1次修改

标题

种属与ABO血型物质检测

审核人

倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2007年月12日1

6.1.2新鲜血液的ABO血型检验

(1) 操作:取新鲜血液各一滴滴加在载玻片的左右两侧,然后在左侧滴加一滴蓝色“抗A”血清,右侧滴加一滴黄色“抗B”血清,用一次性牙签将其分别混匀,手持载玻片,轻轻摇动,观察有无细胞凝集现象,有凝集记为“+”,无凝集记为“一”。

(2) 结果判断

抗A

抗B

血型判断

A型

B型

O型

AB型

   6.2 血斑检验:

   6.2.1肉眼检查

   血液干燥后成为血斑,呈暗红色、褐色、暗褐色。

   6.2.2 预试验

   (1) 原理:血红蛋白或正铁血红素的过氧化物酶活性使过氧化氢释放新生态氧,将无色

联苯胺氧化成蓝色的联苯胺蓝。

   (2) 操作及结果判断:将干净滤纸折叠,用纸角轻擦待检斑痕,然后展开滤纸,平铺于白瓷板上,向擦拭处依次滴加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液各一滴,10-20s后,若无颜色变化,再滴加3%过氧化氢溶液一滴,如系血痕,将立即出现明显的颜色变化(绿色~蓝色)。如果不出现蓝色,或者几分钟后才出现污蓝色,则表明反应呈阴性,不必再作进一步检验。联苯胺试验灵敏度极高(1:100000-500000),微痕量的血斑检材也能得到阳性结果。

(3) 结果评价:M物氧化酶(如大蒜、马铃薯、胡萝卜及其他植物叶汁)、化学氧化剂(如重铬酸钾、高锰酸钾、硫酸铜、甲醛等)、细菌等都可呈假阳性反应。因此,对于联苯胺试验呈阳性的检材,应进一步作确证试验。

6.2.3 确证和种属试验:

   用血红蛋白免疫层析试剂条进行确证试验不仅能证实血斑存在与否,还能直接证明是否为人血。

   (1) 原理:以人血红蛋白(Hb)为抗原,制备针对人Hb的两种不同表位的单克隆抗体,取其中一表位的单抗进行胶体金标记。将另一表位单抗以区带状共价固定于印渍纸的适当位

置,再于该区带上方5mm处固定一常规纯化的抗抗体区带(抗Ig区带)作为质控区带,该印渍纸下端连接一片含金标单抗冻干品的玻璃纤维或石棉纤维,最后在印渍纸的上、下端连接一段吸水条。测试时,将试条下端直接插入样本浸泡液中,若样本内含有人Hb,它将因

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第一版第1次修改

标题

种属与ABO血型物质检测

审核人

倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2007年月12日1

毛细管作用随样本上升至金标抗体区,与之结合形成复合物,然后上升至另一表位单抗区,形成“表位1单抗/抗原/表位2单抗”三元复合物,使该区带显示红色。若标本中不含人Hb,金标抗体区则不能显色。印渍纸上的抗抗体区带为质控区带,若所用的免疫层析试剂条活性未失,则检测时该区带抗Ig抗体能与剩余单抗结合而显示红色。若试剂失效,则该区带无色。

(1) 操作:剪取适量大小的斑迹检材或吸取适量液体检材,置于0.5ml离心管内,加入450μl双蒸馏水,室温放置30分钟,不时振荡。13,000rpm离心5分钟,移上清于另一0.5ml离心管内。将试剂条带MAX标记一端插入上清中,室温静置5分钟,观察结果。

   (2) 结果判断:在质控区和单抗区各出现一条区带者为阳性,提示检材中含有人血;仅在质控区出现一条区带者为阴性,提示检材中不含人血。若在质控区和单抗区均不出现区带,则说明该免疫层析试剂条失效。

   6.3 精斑的检验:

   6.3.1 肉眼检查

   附着于暗色布料上的精斑一般呈灰白色浆糊斑状,有硬感。附着于浅色布料或纸上的精斑一般呈黄白色地图状。精斑在紫外线照射下可发出银白色荧光,斑迹周边则呈紫蓝色。

   6.3.2 预试验

   精斑预试验是一种筛选试验,对疑有精斑存在的检材进行预试验,如果得到阴性结果,可以否定精斑的存在。如果得到阳性结果,则表示所检斑痕中可能含有精斑,有必要作进一步检验。

   (1) 原理:精液的主要成分前列腺液中含有大量的酸性磷酸酶,它可将磷酸苯二钠分解产生酚,后者经铁氰化钾作用,与氨基安替比林结合产生红色类化合物。

   (2) 操作与结果判断:剪取可疑斑迹少许(2mm×2mm),置于白瓷板的凹孔内;另剪取同样大小的无斑迹基质(用作阴性对照)、已知精斑(用作阳性对照),分别置于白瓷板的凹孔内;各加精斑预试验缓冲液3~4滴,于37℃恒温箱中放置5一10min后取出,然后各加3~4滴精斑预试验显色液,立即出现红色者为阳性,呈黄色或橙黄色者为阴性。

   (3) 结果评价:酸性磷酸酶试验灵敏度极高(1:20000),放置10年以上的陈旧精斑或水洗过的精斑仍可检出。若精斑中混有血液,也无影响,因为血在该试验中呈灰褐色。不过,该法所检出的成分不是精斑所特有的,心、肺、肝、肾、胃等内脏的浸液及男性唾液、汗液、尿液和鼻涕等也会呈弱阳性反应。对于预试验呈阳性反应的检材,应进一步作确证试验。

   6.3.3 确证试验:

   若确证试验呈阳性,则可证实精斑的存在。精斑的确证试验方法主要有两类:精子检出法和免疫学检测方法。

   6.3.3.1 精子检出法操作:

   剪取疑有精斑的检材少许(15m15mm),置于小离心管内,加0. 5ml生理盐水,置冰箱冷藏过夜,次日用玻棒或牙签挤压检材,弃去纤维,2500r/min离心5min,上清液可留

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标题

种属与ABO血型物质检测

审核人

倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2014年12月12日

作精斑的免疫学检测;沉渣涂片,干燥后甲醇固定5min,再滴加Baecchi染色液染色,镜检。精子头部呈红色,颈部和尾部染成蓝色。

   对附着在布料上的精斑,还可用直接染色法检出精子,可剪取斑迹少许,放载玻片上,加  生理盐水1滴将纤维浸软,分离,加Baecchi染色液染色,置显微镜下检查,在纤维上或其周围发现着色的精子,在显微镜下检见精子,即可证实检材上留有精斑。

   6.3.3.2 免疫学检测方法:

(1) 原理:以人前列腺蛋白(PSA)为抗原,制备针对人前列腺蛋白的两种不同表位的单克隆抗体,取其中一表位的单抗进行胶体金标记。将另一表位单抗以区带状共价固定于印渍纸的适当位置,再于该区带上方5mm处固定一常规纯化的抗抗体区带(抗Ig区带)作为质控区带,该印渍纸下端连接一片含金标单抗冻干品的玻璃纤维或石棉纤维,最后在印渍纸的上、下端连接一段吸水条。测试时,将该免疫试剂条下端直接插入样本浸出液中,若样本内含有人前列腺蛋白,它将因毛细管作用随样本上升至金标抗体区,与之结合形成复合物,然后上升至另一表位单抗区,形成“表位1单抗/抗原/表位2单抗”三元复合物,使该区带显示红色。若标本中不含人前列腺蛋白,金标抗体区则不能显色。印渍纸上的抗抗体区带为质控区带,若所用的免疫层析试剂条活性未失,则检测时该区带抗Ig抗体能与剩余单抗结合而显示红色。若试剂失效,则该区带无色。

(2) 操作:操作步骤

剪取适量大小的斑迹检材或吸取适量液体检材,置于0.5ml或1.5ml离心管内,加入450μl或1ml双蒸馏水,室温放置30分钟,,期间反复搅动。13,000rpm离心5分钟。将试剂条带MAX标记一端插入上清中,室温静置5分钟,观察结果。

   (3) 结果判断:在质控区和单抗区各出现一条区带者为阳性,提示检材中含有人精斑;仅在质控区出现一条区带者为阴性,提示检材中不含人精斑。若在质控区和单抗区均不出现区带,则说明该免疫层析试剂条失效。

7. 结果记录

   在填写原始记录表格时,对实验所见结果,在法医物证检验原始记录中进行记录。阳性结果的填写方式为在预留的空白方框中打钩、在下划长横线上详细表示;对于阴性结果或未检项目,则以划斜线或留空白方式表示。

8. 相关记录

8.1生物检材预试验与种属、确证试验原始记录  FSC07—TD—M04

8.2 ABO血型检测原始记录                    FSC07—TD—M05

8.3 STR基因型检测原始记录                  FSC07—TD—M06

9.支持性文件

9.1中华人民共和国公共安全全行业标准,法庭科学DNA实验室检验规范 GA/T 383-2002。

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第一版第1次修改

标题

个体识别结果综合评断

审核人

倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2014年12月12日

1.目的

   对法医物证学检验结果进行分析和评判,得出正确的鉴定结论。

2.适用范围

   适用于对法医物证学检验结果作出评判。

3.职责

   中心主任批准具有法医物证鉴定资格的鉴定人履行此项工作。

4.程序

   4.1 概率计算

   4.1.1 亲子鉴定

   (1) 相对亲权概率(RCP)的计算(假设前概率为0.5,被检父与孩子生父为无关个体)

                   RCP =(累积PI值/(累积PI值+1))×100%

   (2)累积PI值(CPI)计算:

       CPI =PI1×PI2 ×PI3 × …×PIn(1,2,3,n代表第1,2,3,n个位点的PI值)

   (3) 各种遗传组合PI值计算方法

p, q, r分别表示等位基因P, Q,R的分布频率。

生母

孩子

生父基因

被检父

PI值


基因型

基因型

(推断)

基因型

计算公式


PP

PP

P

PP

1 /p


PP

PQ

Q

QQ

1 /q


PP

PP

P

PQ

1/2p


PP

PQ

Q

QR

1/2p


PP

PQ

Q

PQ

1/2p


PQ

QQ

Q

QQ

1/q


PQ

QR

R

RR

1/r


PQ

QR

R

RS

1/2r


PQ

PR

R

PR

1/2r


PQ

QQ

Q

QR

1/2q


PQ

PQ

P或Q

PP

1/(p+q)


PQ

PQ

P或Q

QQ

1/(p+q)


PQ

PQ

P或Q

PQ

1/(p+q)


PQ

PQ

P或Q

PR

1/2(p+ q)


PP

PP

1/P


PP

PQ

1/2P


PQ

PP

1/2P


PQ

PQ

1/4p+ 1/4q


PQ

PR

1/4p


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第一版第1次修改

标题

个体识别结果综合评断

审核人

倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2014年12月12日

(4)三联体计算方法举例

在等位基因名称之前加字母“P”,表示其分布频率。

检测系统

生母

孩子

被检父

PI值计算

D3S1358

17,17

17,18

17,18

1/2P18

vWA

18,18

14,18

14,18

1/2P14

FGA

19,24

24,24

24,26

1/2P24

D8S1179

10,13

13,14

13,14

1/2P14

D21S11

31,32.2

29,31

29,29

1/P29

D18S51

14,14

14,17

16,17

1/2P17

D5S818

10,11

10,11

10,12

1/2(P10+P11)

D13S317

10,13

10,11

8,11

1/2P11

D7S820

12,12

12,12

12,12

1/P12

D16S539

9,9

9,11

9,11

1/2P11

TH01

7,8

8,9

9,9

1/P9

TPOX

9,12

11,12

8,11

1/2P11

CSF1PO

10,11

10,11

10,10

1/(P10+P11)

(5)二联体计算方法举例

在等位基因名称之前加字母“P(n),表示其分布频率。

检测系统

孩子

被检父

PI值计算


D3S1358

17,18

17,18

1/4P17+1/4P18


vWA

14,18

14,18

1/4P14+1/4P18


FGA

24,24

24,26

1/2P24


D8S1179

13,14

13,14

1/4P13+1/4P14


D21S11

29,31

29,29

1/2P29


D18S51

14,17

16,17

1/4P17


D5S818

11,12

10,12

1/4P12


D13S317

10,11

8,11

1/4P11


D7S820

12,12

12,12

1/P12


D16S539

9,11

9,11

1/4P9+1/4P11


TH01

8,9

9,9

1/2P9


TPOX

11,12

8,11

1/4P11


CSF1PO

10,11

10,12

1/4P10


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个体识别结果综合评断

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倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2014年12月12日

4.1.2 同一性检验

(1) 偶合率(PM)的计算:

纯合子(Pipi)=Pi2;杂合子(Pipj)=2PiPj

(2) 累积偶合率计算:

累积偶合率=PM×PM×PM×... ×PMn (1,2,3,n代表第1,2,3,n个位点的偶合率)

(3) 基因型偶合率(PM)计算举例:

在等位基因名称之前加字母“P”,表示其分布频率。

检材1

检材2

偶合率

17,18

17,18

P17×P18

14,18

14,18

2×P14×P18

24,24

24,24

P24×P24

13,14

13,14

2×P13×P14

29,31

29,31

2×P29×P31

14,17

14,17

2×P14×P17

11,12

11,12

2×P11×P12

10,11

10,11

2×P10×P11

12,12

12,12

P12×P12

9,11

9,11

2×P9×P11

8,9

8,9

2×P8×P9

11,12

11,12

2×P11×P12

10,11

10,11

2×P10×P11

4.2 鉴定结论的判定依据

   4.2.1 亲子鉴定认定结论的判定依据

   累积PI值大于或等于1999,亲子关系概率大于或等于99.95%。

   4.2.2 亲子鉴定排除结论的判定依据

   (1) 母-子-父三联体三个(含三个)以上的遗传指标不符合遗传规律。

   (2) 母-子或父-子二联体两个(含两个)以上的遗传指标不符合遗传规律。

   4.2.3 同一性检验认定结论的判定依据

 偶合率小于10-9

   4.2.4 同一性检验排除结论的判定依据

   三个(含三个)以上的遗传指标不匹配。

   

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2014年12月12日

4.3 检测结果中出现特殊情况的处理

   4.3.1 亲子鉴定中,在指标排除(位点)少于2个的情形下,需要增加2-4个备用的高度多态性STR遗传指标,如D2S1358, D19S433, PentaD, PentaE等。经统计,在检验这样15--17个STR基因型系统以后,亲子鉴定的累积非父排除率可以达到99%以上,符合国际惯例,满足亲子鉴定的鉴定要求。

   4.3.2 在检测15--17个STR位点以后,仍然只有1个遗传指标排除,对于二联体(如父一子对)案例,可考虑补充孩子生母样本进行检测。检测后若未检见其他排除指标,则这一位点被疑为突变位点,该位点的PI值按以下方法计算:

                         PI=μ/ARE

(μ:该位点的人群突变率若无群体学数据,可使用平均突变率值1.2×10-3;                        ARE:该位点在群体中的非父排除率;)

例如:D3S1358在中国人群中的非父排除率为0.448, μ未检测过,则:

                   PI=1.2×10-3/0 .448=2.68×10-3

   该PI值与检测系统其他位点PI值相乘后获得累积PI值(CPI),若累积PI值(CPI)达到亲子鉴定认定结论标准(大于或等于1999),则可以出具认定结论鉴定报告;若累积PI值(CPI)未达到亲子鉴定认定结论的标准(小于1999),则继续增加检测位点,直至能明确作出认定或排除结论。

   4.3.3 突变位点在原始记录表格中作详实的记录。

   4.3.4 一般情况下,突变位点可不出现在鉴定文书中,以免引起不具备相关专业知识的被鉴定人的疑惑,但在复核案件、多子女亲子鉴定案件等特殊案例中,仍然出现在鉴定文书中,并加以分析说明。

   4.4 质量控制

   4.4.1 进行个体识别时,所有的操作程序必须严格按照相应的作业指导书进行。

   4.4.2 出现下述情形的结果时必须重新抽提、扩增、检测:

   (1) 位点信号不全(如复合体系中部分位点无信号峰或信号峰低于50RFU) ;

   (2) 位点信号不理想(如单位点出现2个以上特征信号峰、峰高值低于50RFU) ;

   (3) 位点信号不正确(如不同体系中相同的位点基因型不一致)。

   4.4.3对涉外、公证、移民等亲子鉴定送检的样本,若发现有亲缘关系不符的情形,则在需要时取复核样进行复验,相同样本的结果应具有重现性。

5.支持性文件

5.1 法庭科学DNA实验室检验规范  GA/T 383-2002

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2014年12月12日

附录

17个ST R位点在中国汉族人群的等位基因分布频率

D3S1358

vWA

FGA

D8S1179

D21S11

11

0.0005

13

0.0020

17

0.0014

8

0.0016

23.2

0.0002

12

0.0014

14

0.2567

18

0.0181

9

0.0011

24.2

0.0002

13

0.0014

15

0.0303

19

0.0433

10

0.1054

27

0.0036

14

0.0473

16

0.1644

20

0.0459

11

0.0936

27.2

0.0002

15

0.3453

17

0.2361

21

0.1072

12

0.1287

28

0.0554

16

0.3277

18

0.1947

21.2

0.0032

13

0.2221

28.2

0.0054

17

0.2062

19

0.0948

22

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14

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29

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18

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20

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22.2

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15

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23

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17

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18

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25

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34.2

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28

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35

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28.2

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35.2

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29

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211.81

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0.0002

225.57

0.0002

211.21

0.0002

220.65

0.0002

湘中司法鉴定中心

作业指导书

文件编号

FSC07—TD—M-2

页号

第6页共7页

版次

第一版第1次修改

标题

个体识别结果综合评断

审核人

倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2014年12月12日

续表

D18S51

D5S818

D13S317

D7S820

D16S539

9

0.0007

7

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7

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7

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5

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8

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8

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8

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6

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10

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9

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9

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11

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10

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12

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13

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15

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14

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14

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14

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16

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15

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15

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14

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17

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17

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15

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18

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19

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21

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22

0.0181

23

0.0090

24

0.0045

25

0.0007

湘中司法鉴定中心

作业指导书

文件编号

FSC07—TD—M-2

页号

第7页共7页

版次

第一版第1次修改

标题

个体识别结果综合评断

审核人

倪  俊

批准人

曾介良

发布日期

2014年12月12日

续表

TH01

TPOX

CSF1PO

D2S1338

D19S433

PentaD

PentaE

6

0.0093

6

0.0007

6

0.0002

16

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11

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6

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5

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7

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7

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7

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17

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12

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7

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7

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8

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8

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8

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18

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12.2

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8

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8

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9

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9

0.1300

9

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19

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13

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9

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9

0.013

9.3

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10

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10

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20

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13.2

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10

0.128

10

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10

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11

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21

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14

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11

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11

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11

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12

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22

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12

0.131

12

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13

0.0007

13

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15

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13

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13

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14

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24

0.1719

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14

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14

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15

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25

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15

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26

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16

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16

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21

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19

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23

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24

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25

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30

0.001

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